明世宗嘉靖三十一年（1552年），李时珍着手开始编写《本草纲目》，以《证类本草》为蓝本，参考了800多部书籍，其间，从嘉靖四十四年（1565年）起，多次离家外出考察，足迹遍及湖广、江西、直隶许多名山大川，弄清了许多疑难问题。
在编写《本草纲目》的过程中，最使李时珍头痛的就是由于药名混杂，往往弄不清药物的形状和生长的情况。过去的本草书，虽然作了反复的解释，但是由于有些作者没有深入实际进行调查研究，而是在书本上抄来抄去，所以越解释越糊涂，而且矛盾百出，使人莫衷一是。
在他父亲的启示下，李时珍认识到，“读万卷书”固然需要，但“行万里路”更不可少。于是，他既“搜罗百氏”，又“采访四方”，深入实际进行调查。
经过27年的长期努力，于明神宗万历六年（1578年）完成《本草纲目》初稿，时年61岁。以后又经过10年三次修改，前后***计40年。万历二十一年（公元1593年）去世。万历二十五年（1596年），也就是李时珍逝世后的第三年，《本草纲目》在金陵（今南京）正式刊行。
李时珍的个人著述
李时珍的著作尚有《奇经八脉考》《濒湖脉学》传世；还有《命门考》《濒湖医案》《五脏图论》《三焦客难》《天傀论》《白花蛇传》等，皆佚。
李时珍感其时代的中医脉学存有缺憾甚至谬误繁多，便依其父李月池所著《四诊发明》及历史上其他多家脉论精华，于1564年（明嘉靖四十三年）编著成《脉诀》，即《濒湖脉学》。
《濒湖脉学》为李时珍晚年所著，以号命书，是为“濒湖脉学”。《濒湖脉学》语言简明，论脉清澈，不但把临床复杂脉象总结归纳成基本的27种脉象，而且还把主要内容，即脉象、相类脉鉴别、脉象主病，皆以韵文歌括形式撰述，便宜诵记，因此上其书流传深广，历来受医家推崇。